pulmoПульмонологияPULMONOLOGIYA0869-01892541-9617Scientific and Practical Journal “PULMONOLOGIYA” LLC10.18093/0869-0189-2021-31-2-178-188pulmo-2326Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL STUDIESОписание редких аллелей гена CFTR при муковисцидозе с помощью функциональных тестов и форсколинового теста на ректальных органоидахDescription of rare alleles of the CFTR gene in cystic fibrosis using functional tests and forskolin-induced swelling assay in rectal organoidshttps://orcid.org/0000-0001-5035-6396ЕфремоваА. С.EfremovaA. S.

Ефремова Анна Сергеевна – к. б. н., старший научный сотрудник лаборатории генетики стволовых клеток.

115478, Россия, Москва, ул. Москворечье, 1; тел.: (495) 324-20-24

Anna S. Efremova, Candidate of Biology, Senior Researcher, Laboratory of Stem Cell Genetics.

ul. Moskvorech’e 1, Moscow, 1115478, Russia; tel.: (495) 324-20-24

anna.efremova.83@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-8814-5532МельяновскаяЮ. Л.MelyanovskayaYu. L.

Мельяновская Юлия Леонидовна – научный сотрудник научно-клинического отдела муковисцидоза.

115478, Россия, Москва, ул. Москворечье, 1; тел.: (495) 324-20-24

Yuliya L. Melyanovskaya, Researcher, Scientific and Clinical Department of Cystic Fibrosis.

ul. Moskvorech’e 1, Moscow, 1115478, Russia; tel.: (495) 324-20-24

melcat@mail.ruБулатенкоН. В.BulatenkoN. V.

Булатенко Наталья Вадимовна – младший научный сотрудник лаборатории генетики стволовых клеток.

115478, Россия, Москва, ул. Москворечье, 1; тел.: (495) 324-20-24

Natal’ya V. Bulatenko, Junior Researcher, Laboratory of Stem Cell Genetics.

ul. Moskvorech’e 1, Moscow, 1115478, Russia; tel.: (495) 324-20-24

bnv695@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-5214-8072ОдинаеваН. Д.OdinaevaN. D.

Одинаева Нисо Джумаевна – д. м. н., профессор, главный врач.

141009, Россия, Московская область, Мытищи, ул. Коминтерна, 24А, стр. 1; тел.: (499) 237-02-23

Niso D. Odinaeva, Doctor of Medicine, Professor, Chief Physician.

ul. Kominterna 24A, build. 1, Mytishchi, Moscow Region, 1141007, Russia; tel.: (499) 237-02-23

info@mokdcd.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2069-7111ОрловА. В.OrlovA. V.

Орлов Александр Владимирович – к. м. н., заведующий 3-м инфекционным отделением.

194156, Россия, Санкт-Петербург, ул. Земледельческая, 2; тел.: (812) 295-69-98

Aleksandr V. Orlov, Candidate of Medicine, Head of the 3rd Infectious Disease Department.

ul. Zemledel’cheskaya 2, Saint-Petersburg, 194156, Russia; tel.: (812) 295-69-98

orlovcf@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5151-586XПашкевичА. А.PashkevichA. A.

Пашкевич Александр Анатольевич – врач-пульмонолог, педиатр 3-го инфекционного отделения.

194156, Россия, Санкт-Петербург, ул. Земледельческая, 2; тел.: (812) 295-69-98

Aleksandr A. Pashkevich, pulmonologist, pediatrician, 3rd Infectious Disease Department.

ul. Zemledel’cheskaya 2, Saint-Petersburg, 194156, Russia; tel.: (812) 295-69-98

pulmonology3@hotmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-7714-9538АдянТ. А.AdyanT. A.

Адян Тагуи Аветиковна – к. м. н., научный сотрудник лаборатории ДНК-диагностики; доцент кафедры общей и медицинской генетики медико-биологического факультета.

115478, Россия, Москва, ул. Москворечье, 1; 117997, Россия, Москва, ул. Островитянова, 1; тел.: (499) 324-87-72

Tagui A. Adyan, Candidate of Medicine, DNA Diagnostics Laboratory; Assistant Professor, Department of General and Medical Genetics, Faculty of Medicine and Biology.

ul. Moskvorech’e 1, Moscow, 1115478, Russia; ul. Ostrovityanova 1, Moscow, 117997, Russia; tel.: (499) 324-87-72

tagui.adyan@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6395-0407КондратьеваЕ. И.KondratyevaE. I.

Кондратьева Елена Ивановна – д. м. н., профессор, заведующая научно-клиническим отделом муковисцидоза; руководитель центра муковисцидоза.

115478, Россия, Москва, ул. Москворечье, 1; 141009, Россия, Московская область, Мытищи, ул. Коминтерна, 24А, стр. 1; тел.: (495) 324-20-24

Elena I. Kondratyeva, Doctor of Medicine, Professor, Head of Research and Clinical Division of Cystic Fibrosis; Head оf Cystic Fibrosis Center.

ul. Moskvorech’e 1, Moscow, 1115478, Russia; ul. Kominterna 24A, build. 1, Mytishchi, Moscow Region, 1141007, Russia; tel.: (495) 324-20-24

elenafpk@mail.ruФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П.Бочкова»РоссияFederal State Budgetary Scientific Institution "Research Center for Medical Genetics"Russian FederationГосударственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Детский клинический многопрофильный центр Московской области»РоссияMoscow Region Children’s Clinical Multidisciplinary CenterRussian FederationСанкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Детская городская больница святой Ольги»РоссияSt. Olga’s Children’s City Hospital, Saint-Petersburg Healthcare InstitutionRussian FederationФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П.Бочкова»; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияFederal State Budgetary Scientific Institution "Research Center for Medical Genetics"; N.I.Pirogov Federal Russian National Research Medical University, Healthcare Ministry of RussiaRussian FederationФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П.Бочкова»; Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Детский клинический многопрофильный центр Московской области»РоссияFederal State Budgetary Scientific Institution "Research Center for Medical Genetics"; Moscow Region Children’s Clinical Multidisciplinary CenterRussian Federation202111042021312178188Copyright © Ефремова А.С., Мельяновская Ю.Л., Булатенко Н.В., Одинаева Н.Д., Орлов А.В., Пашкевич А.А., Адян Т.А., Кондратьева Е.И., 20212021Ефремова А.С., Мельяновская Ю.Л., Булатенко Н.В., Одинаева Н.Д., Орлов А.В., Пашкевич А.А., Адян Т.А., Кондратьева Е.И.Efremova A.S., Melyanovskaya Y.L., Bulatenko N.V., Odinaeva N.D., Orlov A.V., Pashkevich A.A., Adyan T.A., Kondratyeva E.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.pulmonology.ru/pulm/article/view/2326

Муковисцидоз (МВ) – системное наследственное заболевание, обусловленное мутацией гена CFTR и характеризующееся поражением желез внешней секреции, тяжелыми нарушениями функций органов дыхания. Считается, что при «тяжелом» генотипе клинические про- явления более выражены и рано манифестируют. При «мягких» генотипах старт клинических проявлений может быть отсрочен.

Материалы и методы

Материалы и методы. Проведен анализ историй болезни пациентов (n = 2) с МВ без клинических проявлений, наблюдаемых в российских центрах МВ. Для определения разности кишечных потенциалов (ОРКП) и форсколинового теста на кишечных органоидах использовался биопсийный материал прямой кишки. ДНК для секвенирования выделялась из лейкоцитов венозной крови.

Результаты

Результаты. При обследовании у 1-й пациентки (девочка 12 лет) установлен генотип F508del/c.1584+18672A>G, у 2-го (мальчик 3 лет) – F508del/G509D-E217G. Диагноз установлен на основании неонатального скрининга. Методом ОРКП выявлена сниженная функция CFTR-канала (плотность тока короткого замыкания (ΔISC) на форсколин у 1-й пациентки – 12,33 ± 2,35, у 2-го пациента – 25,00 ± 3,37 μA / см2, ответ на карбахол и гистамин в отрицательную сторону отражает вход ионов калия в клетки, что характерно для МВ. По данным форсколинового теста на кишечных органоидах показано, что количество функционального белка на апикальной мембране кишечного эпителия увеличивается при действии как потенциатора, так и корректора у обоих пациентов. Наибольший эффект наблюдается при совместном применении потенциатора VX-770 и корректора VX-809.

Заключение

Заключение. Функциональный тест ОРКП и форсколиновый тест на кишечных органоидах являются чувствительными методами определения остаточной функциональной активности канала CFTR и позволяют уточнить диагноз в сложных случаях. Изученные генетические варианты c.1584+18672A>G и G509D-E217G относятся к мутациям IV–VI класса, клиническая картина соответствует проявлениям «мягких» мутаций. Пациенты продолжают наблюдаться в российских центрах МВ.

Cystic fibrosis (CF) is a systemic hereditary disease caused by a mutation of the CFTR gene and characterized by damage to the glands of external secretion and severe dysfunctions of the respiratory system. The “severe” genotypes are associated with more pronounced and early clinical manifestations. The “mild” genotypes are associated with a delayed onset of clinical manifestations.

Methods

Methods. An analysis of the medical history of patients with asymptomatic CF from the Russian CF centers was carried out. Rectal biopsy specimens were used for intestinal current measurement (ICM) and forskolin-induced swelling assay in intestinal organoids. DNA for sequencing was isolated from the venous blood leukocytes.

Results

Results. 2 CF patients with genotypes F508del/c.1584+18672A>G (patient 1, 12 years old) and F508del/G509D-E217G (patient 2, 3 years old) were examined. The diagnosis was based on neonatal screening. The ICM assay showed a reduced function of the CFTR channel: ΔISC for forskolin was 12.33 ± 2.35 μA/cm2 in patient 1 and 25 ± 3.37 μA/cm2 in patient 2. The negative response to carbachol and histamine reflects the entry of potassium ions into the cells, which is typical for CF. The assay in intestinal organoids showed that the amount of functional protein on the apical membrane of the intestinal epithelium increases both under the action of the potentiator and the corrector in both patients. The greatest effect is observed when the VX-770 and VX-809 are used together.

Conclusion

Conclusion. The ICM functional assay and the forskolin-induced swelling assay in intestinal organoids are sensitive enough to determine the residual functional activity of the CFTR channel and clarify the diagnosis in difficult cases. The studied genetic variants c.1584+18672A>G and G509D-E217G belong to class IV – VI mutations. The clinical picture corresponds to the manifestations of “mild” mutations. The studied patients still attend the Russian cystic fibrosis centers.

муковисцидозгенетические вариантыген CFTRопределение разности кишечных потенциаловбелок CFTRкишечные органоидыфорсколиновый тесткорректор VX-809потенциатор VX-770cystic fibrosisgenetic variantsCFTR geneintestinal current measurementCFTR proteinintestinal organoidsforskolin-induced swelling assayVX-809 correctorVX-770 potentiatorРабота выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации для Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Медико-генетический научный центр имени акаде- мика Н.П.Бочкова» и при финансовой поддержке Благотворительного фонда «Острова»The research was carried out within the state assignment of Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation for Federal State Budgetary Scientific Institution "Research Center for Medical Genetics" and with the financial support of the Charitable Foundation “Ostrova”ReferencesКондратьева Е.И., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., ред. Национальный консенсус «Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия». М.: Боргес; 2018.Kondratyeva E.I., Kashirskaya N.Yu., Kapranov N.I., eds. [National consensus “Cystic fibrosis: definition, diagnostic criteria, therapy”]. Moscow: Borges; 2018 (in Russian).Marson F.A.L., Bertuzzo C.S., Ribeiro J.D. Classification of CFTR mutation classes. Lancet Respir. Med. 2016; 4 (8): е37–38. DOI: 10.1016/S2213-2600(16)30188-6.Marson F.A.L., Bertuzzo C.S., Ribeiro J.D. Classification of CFTR mutation classes. Lancet Respir. Med. 2016; 4 (8): е37–38. DOI: 10.1016/S2213-2600(16)30188-6.De Boeck K. Cystic fibrosis in the year 2020: A disease with a new face. Acta Paediatr. 2020; 109 (5): 893–899. DOI: 10.1111/APA.15155.De Boeck K. Cystic fibrosis in the year 2020: A disease with a new face. Acta Paediatr. 2020; 109 (5): 893–899. DOI: 10.1111/APA.15155.Кистозный фиброз (муковисцидоз): клинические рекомендации. 2020. Доступно на: http://cr.rosminzdrav.ru/schema/372[Cystic fibrosis: clinical guidelines. 2020]. Available at: http://cr.rosminzdrav.ru/schema/372 (in Russian).Derichs N., Sanz J., Von Kanel T. et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 2010; 65 (7): 594–599. DOI: 10.1136/THX.2009.125088.Derichs N., Sanz J., Von Kanel T. et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 2010; 65 (7): 594–599. DOI: 10.1136/THX.2009.125088.Мельяновская Ю.Л., Кондратьева Е.И., Куцев С.И. Определение референтных значений для метода определения разности кишечных потенциалов в Российской Федерации. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2020; 15 (2): 162–165. DOI: 10.14300/MNNC.2020.15039.Melyanovskaya Yu.L., Kondratyeva E.I., Kutsev S.I. [Determination of reference values for the method of intestinal current measurement in the russian federation]. Meditsinskiy vestnik Severnogo Kavkaza. 2020; 15 (2): 162–165. DOI: 10.14300/mnnc.2020.15039 (in Russian).Dekkers J.F., van der Ent C.K., Beekman J.M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Dis. 2013; 1 (1): e27112. DOI: 10.4161/rdis.27112.Dekkers J.F., van der Ent C.K., Beekman J.M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Dis. 2013; 1 (1): e27112. DOI: 10.4161/rdis.27112.Dekkers J.F., Berkers G., Kruisselbrink E. et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci. Transl. Med. 2016; 8 (344): 344ra84. DOI: 10.1126/scitranslmed.aad8278.Dekkers J.F., Berkers G., Kruisselbrink E. et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci. Transl. Med. 2016; 8 (344): 344ra84. DOI: 10.1126/scitranslmed.aad8278.Boj S.F., Vonk A.M., Statia M. et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. J. Vis. Exp. 2017; (120): е55159. DOI: 10.3791/55159.Boj S.F., Vonk A.M., Statia M. et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. J. Vis. Exp. 2017; (120): е55159. DOI: 10.3791/55159.Vonk A.M., van Mourik P., Ramalho A.S. et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protoc. 2020; 1 (1): 100019. DOI: 10.1016/J.XPRO.2020.100019.Vonk A.M., van Mourik P., Ramalho A.S. et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protoc. 2020; 1 (1): 100019. DOI: 10.1016/J.XPRO.2020.100019.Кондратьева Е.И., Мельяновская Ю.Л., Ефремова А.С. и др. Опыт применения методов оценки функциональности анионного канала CFTR у пациентов с установленным и предполагаемым диагнозом муковисцидоза. Сибирское медицинское обозрение. 2019; (2): 60–69. DOI: 10.20333/2500136-2019-2-60-69.Kondratyeva E.I., Melyanovskaya Yu.L., Efremova A.S. et al. [Experience of evaluating functionality of anionic CFTR channel methods application in patients with cystic fibrosis diagnosed and supposed]. Sibirskoe meditsinskoe obozrenie. 2019; (2): 60–69. DOI: 10.20333/2500136-2019-2-60-69 (in Russian).Costantino L., Rusconi D., Soldà G. et al. Fine characterization of the recurrent c.1584+18672A>G deep-intronic mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2013; 48 (5): 619–625. DOI: 10.1165/rcmb.2012-0371OC.Costantino L., Rusconi D., Soldà G. et al. Fine characterization of the recurrent c.1584+18672A>G deep-intronic mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2013; 48 (5): 619–625. DOI: 10.1165/rcmb.2012-0371OC.Амелина Е.Л., Каширская Н.Ю., Кондратьева Е.И. и др., ред. Регистр больных муковисцидозом в Российской Федерации. 2018 год. М.: Медпрактика-М; 2020. Доступно на: https://mukoviscidoz.org/doc/registr/web_block_Registre_2018.pdfAmelina E.L., Kashirskaya N.Yu., Kondratyeva E.I. et al., eds. [Russian Federation cystic fibrosis patients Registry. 2018 year]. Moscow: Medpraktika-M; 2020. Available at: https://mukoviscidoz.org/doc/registr/web_block_Registre_2018.pdf (in Russian).Кондратьева Е.И., Мельяновская Ю.Л., Петрова Н.В. и др. Клинико-генетическая характеристика больных муковисцидозом и функциональная оценка работы хлорного канала с впервые описанным патогенным вариантом D579Y (c.1735G>T). Медицинский вестник Северного Кавказа. 2020; 15 (2): 166–169. DOI: 10.14300/mnnc.2020.15040.Kondratyeva E.I., Melyanovskaya Yu.L., Petrova N.V. et al. [Clinical and genetic characteristics of cystic fibrosis patients and a functional assessment of the work of the chloride channel with the first described pathogenic variant D579Y (с.1735G>T)]. Meditsinskiy vestnik Severnogo Kavkaza. 2020; 15 (2):166–169. DOI: 10.14300/mnnc.2020.15040 (in Russian).Southern K.W., Patel S., Sinha I.P., Nevitt S.J. Correctors (specific therapies for class II CFTR mutations) for cystic fibrosis. Cochrane Database Syst. Rev. 2018; 8 (8): CD010966. DOI: 10.1002/14651858.CD010966.pub2.Southern K.W., Patel S., Sinha I.P., Nevitt S.J. Correctors (specific therapies for class II CFTR mutations) for cystic fibrosis. Cochrane Database Syst. Rev. 2018; 8 (8): CD010966. DOI: 10.1002/14651858.CD010966.pub2.Stanojevic S., Davis S.D., Retsch-Bogart G. et al. Progression of lung disease in preschool patients with cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2017; 195 (9): 1216–1225. DOI: 10.1164/rccm.201610-2158OC.Stanojevic S., Davis S.D., Retsch-Bogart G. et al. Progression of lung disease in preschool patients with cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2017; 195 (9): 1216–1225. DOI: 10.1164/rccm.201610-2158OC.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.